1、中，冰上静置。每个管中加入氯仿，混匀后冰上静置，离心。将上清转移至管中，加入异丙醇，充分混匀后离心。弃上清，加入水配制成的乙醇，混匀后离心，弃上清，冰上干燥。加入水溶解，紫外检测浓度，琼脂糖凝胶电泳检测质量。保存。反转录获取细胞中使用反转录试剂盒将细胞中总反转录为。取，加入引物，用水将体系调整为，混匀后，放入仪中加热后停止。取反应缓冲液酶抑制剂反转录酶混匀后加入预热后的反应体系中，混匀。置于仪中反应后，反应。得到的于保存。获取野生人源性目的基因以为模版，获取野生人源性目的基因。设计人源性基因的特异性引物，上游引物序列为末端添加个保护碱基和酶切位点下游引物序列为末端添加个保护碱基和酶切位点。反应体系为引物上游引物与下。

2、基础培养基更换为完全培养基。转染后收集细胞，进行后续检测。蛋白浓度测定样本处理使用法检测蛋白浓度。将试剂盒中液与液以混合，在混合液中加入及待测样品。混合均匀后，孵育，设置个复孔，用酶标检测仪检测波长处吸光值。绘制标准曲线用将稀释为与蛋白样品同法检测其吸光值，在表格中以吸光值为横坐标，浓度为纵坐标绘制散点图，添加线性回归线万方数据三峡大学硕士学位论文及其公式。得出标准曲线公式为，。蛋白浓度的计算细胞裂解液与的吸光度之差为样品吸光度的校正值，将样品吸光度值与吸光度校正值之差代入标准曲线求出值乘以稀释倍数，则得到样品的蛋白浓度。多胺含量的测定标准曲线的绘制以盐酸作溶剂配制的腐胺精脒以及精胺。苯甲酰化处理取，加入腐胺内标化。

3、纸及海绵，检查无气泡产生后，合上夹子放入加入转膜缓冲液的转膜槽子中，以电流恒流转膜，转膜槽子四周应用冰块进行降温，以防蛋白降解。抗体孵育将膜放入脱脂牛奶中，封闭，加入脱脂牛奶配制的抗，摇床孵育过夜，洗次，每次，加入配制的二抗，室温摇床孵育，洗次，每次。显色在暗室中，膜用滤纸吸干，放入显影夹中，将显色用液与液等体积混合，滴于膜上，待显色液扩散，在膜上覆盖塑料薄膜，放上胶片，合上显影夹，根据荧光强弱确定显影时间。胶片依次通过显影液水定影液，水中去除定影液后晾干保存。真核表达质粒的构建万方数据三峡大学硕士学位论文人宫颈癌细胞中总的提取细胞生长至融合时，用洗两次，每个细胞瓶中加入，冰上静置，用细胞刮将细胞刮下，转移至无菌管。

4、中于细胞培养箱中培养。冻存细胞细胞生长至融合，用清洗细胞后加入胰酶消化细胞，终止消化后收集细胞，离心后弃上清，加入冻存液重悬细胞，转入细胞冻存管中置于细胞冻存盒，放置后从冻存盒中取出至细胞盒或液氮罐中。细胞计数细胞用胰酶消化，离心，弃上清，洗次，重悬细胞，取细胞悬液，加入台盼蓝染液，混匀后，取混合液至计数板，对计数板个大格小格的细胞进行计数。若细胞量较大可根据细胞量进行适当稀释。细胞浓度为个，个小格中细胞总个数，稀释倍数。质粒转染细胞细胞传代培养于培养皿后，待细胞融合至，将完全培养基更换为基础培养基。后，取基础培养基分别与脂质体和质粒混匀，静置。将含脂质体与含质粒的基础培养基混匀，静置，逐滴加入细胞培养皿中。后，将。

5、别与内标峰面积的比值代入各标准曲线方程，得到样品的质量浓度，结合蛋白定量结果计算腐胺精脒及精胺的含量。检测细胞内蛋白表达水平样本处理细胞用胰酶消化后，离心，洗次，加入细胞裂解液裂解细胞，离心，取上清，检测蛋白浓度，定量后加入蛋白上样缓冲液，混匀后，沸水中水浴。聚丙烯酰胺凝胶电泳待分离胶与浓缩胶均凝固后，在电泳槽中加入电泳缓冲液，根据蛋白定量结果依次上样，同时加入蛋白预染作为蛋白大小指示。以电压恒压电泳，待溴酚蓝指示带进入分离胶后约，将电压调至，恒压进行电泳，至溴酚蓝指示带电泳至分离胶底部结束电泳约。转膜在转膜夹子上依次放入转膜缓冲液完全浸泡的海绵及张滤纸，电泳后的聚丙烯酰胺凝胶，甲醇激活的膜，转膜缓冲液完全浸泡的张。

6、游引物各混合聚合酶。充分混合后瞬时离心，放入仪中。反应条件预变性变性，退火，延伸循环次延伸。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。空载质粒与野生人源性目的基因的酶切在空载质粒与获得的人源性目的基因中各加入限制性内切酶限制性内切酶酶切缓冲液，调节反应体系至，水浴，纯化酶切后产物。万方数据分类号密级公开硕士学位论文肿瘤细胞中多胺代谢与信号通路关系的研究学位申请人王清学科专业药理学指导教师王艳林教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成。

7、合物己二胺苯甲酰氯，涡旋振荡器振荡混匀后，恒温水浴箱水浴后，加入饱和氯化钠终止反应。在通风橱中，于苯甲酰化后的样品中加入乙醚，进行抽提，重复三次，将三次抽提液合并，在通风橱中待其挥发干燥。色谱纯的甲醇溶解沉淀后，以微孔滤膜过滤溶液，用型高效液相色谱仪检测样品中腐胺精脒或精胺的含量，检测波长均为，流动相为乙腈水，上机前乙腈与水需经微孔滤膜过滤后在超声清洗机中进行脱气。依次检测腐胺的含量。样品峰面积与内标峰面积的比值为，样品的质量浓度为，绘制腐胺的标准曲线。相同方法进行精脒精胺标准曲线的绘制。腐胺标准曲线精胺标准曲线精脒标准曲线，。样本的处理将待检测的细胞样本消化后收集，离心，弃上清，加入重悬细胞，离心，弃上清。加入细。

8、且临床应用疗效不佳的重要原因。如果在用耗竭多胺的同时还阻断细胞内的信号通路，将可大幅度提高对肿瘤细胞的杀伤活性，降低药物用量和药物的毒副作用。为验证上述假说，本研究以人肺癌细胞为研究对象，探讨多胺代谢通路与信号通路之间的相互关系，并通过联合使用与激酶抑制剂处理细胞，分析其对于肿瘤增殖是否有协同抑制效应。方法使用高效液相色谱检测对于细胞中多胺含量的影响，检测对细胞中磷酸化水平的影响构建显性负突变真核表达质粒使用激酶抑制剂或转染显性负突变真核表达质粒，分析降低磷酸化水平对细胞中多胺含量的影响。在用降低细胞中多胺含量的同时抑制磷酸化水平，分析二者联用在抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡中的协同作用。结果可显著降低细胞中腐。

9、裂解液，冰上裂解，离心，将上清转移至管中。检测细胞中蛋白浓度。取细胞裂解液，加入内标化合物苯甲酰氯，涡旋振荡器振荡混匀后，恒温水浴箱水浴后，加入饱和氯化钠。在通风橱中，于苯甲酰化后的样品中加入乙醚，进行抽提，重复三次，将三次抽提液合并，在通风橱中待其挥发干燥。色谱级甲醇溶解沉淀后，以微孔滤膜过滤溶液，用万方数据三峡大学硕士学位论文型高效液相色谱仪检测样品中腐胺精脒以及精胺的含量，检测波长均为，流动相为乙腈水。对样本进行检测时，于同波长下同时检测腐胺精脒精胺的含量，为内标化合物，出峰顺序为腐胺精脒己二胺精胺，出峰时间为。多胺浓度的计算通过标准曲线方程计算多胺含量。将高效液相色谱仪检测得到样品中腐胺精脒及精胺的峰面积分。

10、目的多胺是类带有正电荷的烷基胺类小分子，存在于所有细胞中。研究表明，肿瘤细胞的快速增殖高度依赖于细胞内的多胺含量，使用多胺耗竭试剂减少肿瘤细胞中的多胺能有效抑制肿瘤细胞增殖。作为多胺合成代谢限速酶鸟氨酸脱羧酶的特异性抑制剂，它可在细胞水平上通过耗竭多胺而抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，然而要达到上述抗肿瘤效应需要较高的药物剂量，在临床试验中，这种高剂量所产生的毒副作用极大地限制了它在抗肿瘤治疗中的应用。最近有报道指出，处理可激活细胞内的信号通路，而该信号通路的活化可促进细胞增殖和拮抗细胞凋亡。因此我们推测，用耗竭多胺可导致细胞代偿性上调信号通路的活性，由此拮抗对细胞增殖的抑制作用，这可能是需要高剂量方能抑制肿瘤细胞增。

11、胺精脒精胺的含量对细胞中蛋白总量及的磷酸化水平无明显影响，但可增加的磷酸化水平，补充腐胺精脒精胺均可逆转引起的磷酸化水平增加成功克隆并构建野生型及显性负突变型真核表达质粒使用激酶抑制剂或转染显性负突变真核表达质粒在抑制磷酸化的同时，还可显著降低细胞中的多胺含量降低磷酸化水平可促进对细胞的增殖抑制及凋亡促进作用。结论用处理肺癌细胞导致的多胺水平下降可上调的磷酸化水平单纯抑制信号通路也可降低细胞内多胺含量，提示多胺代谢与信号通路之间存在功能上相互制约的关系。与信号通路抑制剂联合万方数据三峡大学硕士学位论文应用能显著性增强对肺癌细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用。关键词多胺二氟甲基鸟氨酸磷酸化肺癌细胞万方数据三峡大学硕士学位论。

12、。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要。

参考资料：

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[20]贵州省苗族侗族风情展示动态PPT课件 编号18060（第18页，发表于2022-06-24）