1、离心分钟收集溶液在紫外分光光度计上测定收集到的溶液的浓度，先取调零，再取溶液测定，记录下溶液的浓度和的比值，剩余于保存。克隆产物末端天然加，而载体末端有碱基突出，利用该原理可以快速得到重组质粒。在仪上连接小时。重叠延伸法制备缺失突变质粒和万方数据图重叠延伸法制备缺失突变质粒原理图引物的选择按照前文所述，其中,为质粒,为质粒,为,。其中,共同缺失共同缺失。按照反应体系扩增片段,。将片段,和引物混合因含有共同序列可以互为引物延伸，然后通过引物大量扩增出缺失和的长片段，反应条件同上，体系如下引物引物万方数据将缺失长片段。

2、血样，各加入蛋白酶，充分混匀加入缓冲液，充分颠倒混匀放置分钟，溶液应变清亮加人无水乙醇，充分振荡混匀秒，此时可能会出现絮状沉淀将上步所得溶液和絮状沉淀都加入个吸附柱中离心秒，倒掉废液向吸附柱中加入缓冲液离心秒，倒掉废液向吸附柱中加入漂洗液,离心秒，倒掉废液向吸附柱中加入漂洗液离心秒，倒掉废液将吸附柱放回收集管中离心分钟，倒掉废液。将吸附柱置于恒温烘箱分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液⑩将吸附柱转入个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加，室温放置分钟离心分钟，将溶液收集到离心管中保存。组织基因组样本采集于。

3、试剂盒说明书回收反应液中的产物。柱平衡步骤向吸附柱中加入的平衡液,离心份钟，倒掉收集管中的废液估计反应液的体积，向其中加入等倍体积溶液，充分混匀对于回收的小片段可将溶液的体积增加到倍将上步所得溶液加入个吸附柱中，室温放分钟，离心分钟，倒掉收集管中的废液，吸附柱容积为，若样品体积大于可分批加入上游引物下游引物模板万方数据向吸附柱中加入漂洗液使用前加入无水乙醇，离心分钟，倒掉收集管中的废液重复操作步骤将吸附柱放回收集管中，离心分钟，再置于室温分钟，彻底晾干将吸附柱放入个干净离心管中，在吸附膜中央悬空滴加，室温放置分钟。

4、“”,“”,,万方数据酶切位点，利用软件设计普通引物。下划线为酶切位点下划线为酶切位点分子开关所用检测引物根据分子开关原理以及基因外显子缺失序列设计硫化修饰引物以及公用的反向引物。其中加粗且带有下划线标记的为突变位点，处为硫化修饰位置，和公共反向引物检测基因号外显子缺失，长度为，和公共反向引物检测基因号外显子缺失，长度为。万方数据四模板和样品采集血液基因组模板采集于苏大附二院采集两管正常人血液，置于抗凝管中保存，取血样，按照血液细胞组织基因组提取试剂盒说明书操作。使用前先在缓冲液和漂洗液中加入无水乙醇将血样分为管。

5、提供，加入到膜的中部，关盖并在室温放置分钟分钟洗脱核酸，于保存。五构建突变质粒和野生质粒基因野生型质粒的制备扩增反应万方数据引物按照上文所述选择，预变性变性，退火，没有延伸时间终延伸。产物鉴定称取琼脂糖，放入锥形瓶中，并倒入溶液，微波炉加热分钟，结束后凝胶溶液应为清亮，在小烧杯中倒入凝胶溶液，待其冷却至左右加入，充分混匀，倒入凝胶槽中，插上梳子，室温静置小时后拔出梳子使用。产物点样时无需添加溴酚蓝，产物点样时产物与混匀后点样，电压跑后取出置于凝胶成像仪中观察产物大小。产物回收确认产物大小正确以后，按照通用型纯化回。

6、纯化回收，与载体进行克隆，体系同前所述。质粒的转化和提取质粒的转化按照感受态细胞说明书操作。将感受态细胞从冰箱中取出，置于冰盒中，取上述连接产物加入其中，冰上放置，隔轻弹管底部混匀混合物水浴秒，立即放冰上于超净台内每管加入液体培养基摇床培养分钟离心分钟，于超净台内吸取上清，用枪头吹打剩余溶液，使管底部的细菌充分悬浮吸取细菌悬液，涂布于抗性固体培养基上，晾干以后倒置于恒温培养箱内过夜第二天若观察得到细菌长出，挑选单菌落，接种于液体培养基中含摇床过夜培养第三天选取细菌浑浊液，冻存管中加入菌液，甘油保种，剩余提取质粒。。

7、大附二院采集份肺癌病人组织样本，置于管中，用酒精擦拭过的小剪刀将份肺癌病人组织组织样本剪碎，每剪好份都必须用酒精擦拭过再进行份的操作，按照血液细胞组织基因组提取试剂盒说明书操作。加缓冲液，振荡至彻底悬浮。加入蛋白酶，充分混匀，放置于恒温水浴中，隔段时间可上下颠倒数次，直至组织溶解。⑩同血液基因组提取方法相同。万方数据血中游离样本采集于苏大附二院采集与份肺癌病人组织样本对应的管肺癌病人血液，置于抗凝管中保存，按照，提取血中游离。先将份血液样本离心，离心分钟，尽可能多的吸取上层血浆，剩余的血液保存。取蛋白酶，血浆，加。

8、不得以其它单位的名义发表。本人同意南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年。

9、离心管加含，震荡秒后，立即水浴分钟水浴结束后加入，震荡秒，冰浴以上混合物分钟将柱放入，在柱中加入延长管将中的混合物加入延长管，过柱，开真空泵，当所有溶解产物完全不沉时，关真空泵并将压力调到，小心去除延长管加入柱，开管盖并打开真空泵，当所有被甩出柱时，关真空泵并将压力调到加入柱，开管盖并打开真空泵，当所有被甩出柱时，关真空泵并将压力调到纯乙醇加入柱，开管盖并打开真空泵，当所有纯乙醇被甩出柱时，关真空泵并将压力调到⑩盖上管盖，丢弃，将柱放入收集管中，离心分钟将柱放入新的收集管中，开盖分钟，使膜完全干燥将柱放入洗脱管已。

10、学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容。

11、日年月日万方数据主要英文缩略语索引中文摘要引言实验材料主要仪器主要试剂及来源实验方法主要溶液的配置相关生物信息学软件与网站引物设计模板和样品采集构建突变质粒和野生质粒利用原核蓝白筛选检测血中游离缺失突变利用分子开关检测基因组突变实验结果构建野生型质粒和缺失突变型质粒利用蓝白筛选检测结果组织模板的鉴定利用分子开关检测结果阴性样本的测序鉴定万方数据讨论实验结论参考文献综述硕士期间研究成果致谢万方数据主要英文缩略语索引英文缩写英文全称中文全称表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂脱氧核糖核酸循环阈值聚合酶链反应单核苷酸的多态。

12、提质粒按照质粒小体试剂盒说明书操作。柱平衡步骤向吸附柱中加入的平衡液,离心分钟，倒掉收集管中的废液取过夜培养的菌液，离心分钟，尽量吸除上清向留有菌体沉淀的离心管中加入溶液确定加入，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀向离心管中加入溶液，温和上下翻转次，使菌体充分裂解向离心管中加入溶液，立即温和上下翻转次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，离心分钟万方数据分类号密级编号硕硕士士学学位位论论文文肺癌的基因突变检测方法研究研究生姓名汤丽梦指导教师姓名职称李凯教授郭紫芬副教授学科专业名称药理学研究方向分子药理学年月万方数据南华大。

参考资料：

[1]红色党课党政党建中国共产党党员的义务和权利PPT模 编号38（第35页，发表于2022-06-25）

[2]红色党课党政党建中国共产党党员的义务和权利PPT模 编号45（第35页，发表于2022-06-25）

[3]红色党课党政党建中国共产党党员的义务和权利PPT模 编号50（第35页，发表于2022-06-25）

[4]红色党课党政党建中国共产党党员的义务和权利PPT模 编号34（第35页，发表于2022-06-25）

[5]红色党课党政党建中国共产党党员的义务和权利PPT模 编号43（第35页，发表于2022-06-25）

[6]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号39（第28页，发表于2022-06-25）

[7]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号40（第28页，发表于2022-06-25）

[8]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号44（第28页，发表于2022-06-25）

[9]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号39（第28页，发表于2022-06-25）

[10]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号34（第28页，发表于2022-06-25）

[11]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号22（第28页，发表于2022-06-25）

[12]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号24（第28页，发表于2022-06-25）

[13]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号30（第28页，发表于2022-06-25）

[14]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号53（第28页，发表于2022-06-25）

[15]红色党政党建党课杜绝餐饮浪费践行节约风尚课件PPT 编号55（第28页，发表于2022-06-25）

[16]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号40（第21页，发表于2022-06-25）

[17]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号31（第21页，发表于2022-06-25）

[18]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号35（第21页，发表于2022-06-25）

[19]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号23（第21页，发表于2022-06-25）

[20]红色党政党课党建如何做好一名基层党支部书记PPT 编号37（第21页，发表于2022-06-25）