1、液的配制生理盐水甘油肉汤羊血琼脂培养基液体培养基的配制同第部分。表主要培养基和试剂的配方及配制方法培养基或试剂成分配方配制方法琼脂琼脂琼脂，蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。电泳缓冲液冰醋酸冰醋酸蒸馏水定容至混匀后，调节值在范围内，高压蒸汽灭菌，保存备用。温州医科大学硕士学位论文琼脂糖凝胶琼脂糖干粉琼脂糖干粉缓冲液琼脂糖干粉和缓冲液混匀后，微波炉高热加热至沸腾，取出摇晃，中低热再次加热至完全溶解，冷却至左右，加入左右的，混匀后缓慢倒入电泳模具中，自然凝固后使用。刚果红平板刚果红，胰蛋白胨，酵母浸出液刚果红胰蛋白胨酵母，蒸馏水定容至刚果红溶解至蒸馏水中，经径迹蚀刻膜过滤达到无菌状态，加入到高压并冷却至的无盐琼脂培养基中混匀，倾注至无菌平皿中，无菌试验检测合格后，。
2、时制备不含药的空白板。温州医科大学硕士学位论文接种物的准备和接种用无菌生理盐水将细菌调成麦氏比浊，吸取上述菌液至生理盐水中进行稀释，取稀释好的菌液加入到孔板中，以自制多点接种器蘸取菌液约接种于琼脂平板表面接种顺序是从低浓度到高浓度，缓慢移动至旁待菌液被琼脂完全吸收后，置孵箱中培养。结果判读将平板置于暗色无反光物体表面，先观察空白板上面的菌落分布情况是否与点样记录致，并观察是否存在污染。随后读取完全抑制菌落生长的最低药物浓度即值。注意大肠埃希菌要求结果在参考范围以内，若超出参考范围，则本次药敏试验的结果不可信，需重复试验。孔板结晶紫染色法测定体外生物膜形成能力生物膜的培养和测定方法同第部分。生物膜形成相关表型的检测超粘表型检测将保存的株用接种环三区划线接种至哥伦比亚血平板上，置孵箱中培养。
3、并且我们猜测其生物膜的形成与其耐药性有定的相关性。接下来的研究将从多个方面详细分析其体外形成生物膜的特点及相关机制，以期为临床上存在的些药物体外敏感而体内治疗失败的问题提供理论依据，进而指导临床更有效的使用抗菌药物。第二部分耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌生物膜形成能力相关特性研究通常同时对头孢菌素类喹诺酮类以及氨基糖苷类药物表现出耐药，具有多重耐药甚至是范耐药的表型，而目前国内外关于其的研究主要针对分子耐药机制，包括碳青霉烯酶外膜蛋白的突变会缺失外排泵表达量的增加等。我们知道细菌耐药性的产生往往是复杂的多种机制共同导致的，关于多重耐药的铜绿假单胞菌鲍曼不动杆菌以及金黄色葡萄球菌的研究均已涉及到生物膜形成能力的研究，肺炎克雷伯菌生物膜相关数据的缺乏促使我们进行本部分的研究。材料与方法材料实验菌株。
4、保存备用。方法琼脂稀释法检测碳青霉烯类药物对具体的最低抑菌浓度细菌的培养将保存的株和药敏质控菌用接种环接种至哥伦比亚血平板上，置孵箱中培养。抗菌药的配制参照中肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物的敏感和耐药的界值及质控菌对该类药物的范围，设定各种药物的最高终浓度和最低终浓度，本实验中各种碳青霉烯类药物的终浓度范围为。根据以下公式计算每种药物的质量质量稀释剂用量原液浓度分析效能，以文件推荐的溶解溶剂和稀释溶剂分别进行溶解和倍比稀释。含药琼脂平板的制备用离心管量取已经高压并冷却至的琼脂，从低浓度到高浓度的顺序将倍比稀释的药物加入到琼脂中，混匀后倾注到无菌的塑料平皿中，整个过程要严格无菌操作，待平皿自然冷却凝固后铺开，紫外灯下吹干备用。注意含药平板要新鲜配制使用，以避免药物消耗所引起值测定的误差要同。
5、外科，共占药物敏感性结果显示我院肺炎克雷伯菌对氨苄西林的耐药率接近，对呋喃妥因的耐药率已高达，对包括头孢曲松头孢他啶在内的三代头孢菌素类甚至是酶抑制剂复合药物氨苄西林舒巴坦的耐药率也都在以上，仅对四代头孢菌素的头孢吡肟的敏感性较好对喹诺酮来药物和氨基糖苷类药物的总体耐药水平较接近，处于之间仅对碳青霉烯类药物亚胺培南的敏感性最好，总体耐药率仅为。体外生物膜形成能力的初步分析发现痰液标本来源的菌株形成生物膜的能力高于其他标本来源。株试验菌株对碳青霉烯类药物亚胺培南美罗培南厄他培南中的种甚至是三种药物表现出不同程度的敏感性下降或者耐药。同时发现在近几年中呈现明显的上升趋势，且主要集中在痰液标本。而总体的生物膜形成能力与第部分试验中各类标本的总体水平无差异，中痰液标本生物膜形成能力与第部分试验。
6、机制研究答辩委员会主席答辩委员会成员论文答辩日期温州医科大学硕士学位论文目录缩略词表中文摘要英文摘要前言第部分年年间临床分离肺炎克雷伯菌耐药特性研究和不同标本来源的菌株的体外生物膜形成能力测定材料和方法结果分析与讨论第二部分耐碳氢霉烯肺炎克雷伯菌生物膜形成能力相关特性研究材料和方法结果分析与讨论第三部分生物膜形成和外排泵的相关性研究材料和方法结果分析与讨论全文小结正文参考文献附录致谢综述综述参考文献论文独创性声明温州医科大学硕士学位论文缩略词表缩写英文全称中文全称美国典型菌种保藏中心碱基对临床实验室标准化研究所耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌碳青霉烯敏感型肺炎克雷伯菌焦碳酸二乙酯脱氧核糖核苷三磷酸超广谱内酰胺酶厄他培南小时中介亚胺培南肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶鲁利亚培养基生物膜最低消除浓度美罗培南最。
7、士学位论文下高。结论本院临床分离的肺炎克雷伯菌标本来源主要来自于痰液，主要分离的科室是，对多种药物耐药情况严重，仅对碳青霉烯类药物保持较好的敏感性。痰液标本分离的肺炎克雷伯菌体外形成生物膜的能力最强，同时我院大部分分离自痰液，且此类耐药菌株逐年增多。菌株形成生物膜的能力与碳青霉烯类耐药程度无相关性，不能认为单的生物膜屏障作用就能造成耐药性的增强。本研究还证明生物膜形成能力与多种毒力表型和基因型无关，且不具有特定的流行分布特点。对试验菌株的生物膜的值相较于对应菌株的升高了倍，在定程度上解释了临床上发生的药物体外敏感而体内治疗无效的现象。的值的高低与细菌形成生物膜的值的高低之间没有相关性，进步证明生物膜细菌对抗菌药物的高水平耐药不是通过生物膜的物理屏障作用阻止其渗透入细菌内部来产生的。外排。
8、左右取出混匀下。加入，随后加入，充分混匀。于环境中水浴，然后移出，对于难裂解的样本可以适当延长水浴时间。水浴后向混合液中加入，并混合均匀离心，将上清液转移到个新的离心管中，加的，并混合均匀。将混合液体转移至中，注意透明粘稠样物质为，需并转移，随后于离心，并弃去接液管中的液体，向中加入的，于离心，并弃去接液管中的液体。向中加入，于离心，并弃去接液管中的液体，重复上述步骤的操作次再次将于离心，并将转移至个新的离心管中。向中加入，并于下温浴，温州医科大学硕士学位论文分类号单位代码学号硕士学位论文论文题目耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关机制研究研究生姓名学科专业临床检验诊断学类型学术型指导教师二四年三月温州医科大学硕士学位论文论文题目耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关。
9、获得的痰液标本之间也无差异具有超粘特性的菌株产纤维素的菌株形成生物膜的能力并不比表型试验阴性的菌株强，编码菌毛的毒力基因缺失的菌株形成生物膜的能力并没有降低型别菌株生成生物膜的能力与其他型别相比无明显差异。对试验菌株的值范围为，都表现为敏感，而值的范围为，都表现为耐药。但对细菌的值的大小与细菌形成生物膜的能力并没有相关性，即并不是生物膜的值越高，就越高。含亚抑菌浓度的培养基下培养的生物膜的值比不含培养基培养的生物膜值都有不同幅度的提高，即亚抑菌浓度的对每株菌生物膜的形成能力都表现出不同程度的促进作用。另外，外排泵缺失的试验菌株比外排泵基因完整的试验菌株形成生物膜的值的水平低。细菌试验状态生物膜状态含浮游状态含生物膜状态下外排泵基因的表达量都比校准状态不含培养基的细菌浮游态温州医科大学硕。
10、温州医科大学硕士学位论文研究菌株为第部分分析筛选的株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌，药敏试验质控菌大肠埃希菌购自卫生部临检中心实验阳性对照为本实验室扩增阳性并测序确认后的保存菌株。抗菌药物亚胺培南厄他培南美罗培南，等抗菌药物标准品购自中国药品生物制品检定所。主要材料和试剂细菌提取试剂盒杭州昊天生物科技有限公司反应原料和大连有限公司引物合成及产物测序委托华大基因普通电泳琼脂糖干粉法国有限公司，琼脂英国有限公司核酸染料温州长风生物科技有限公司刚果红美国公司冰醋酸国药集团化学试剂有限公司。生物膜形成试验相关的试剂同第部分。主要仪器和设备聚合酶链反应仪仪凝胶电泳成像分析仪型电热恒温水槽上海森信实验仪器有限公司型离心机，分光光度计美国有限公司全功能微孔板检测酶标仪美国公司径迹蚀刻膜美国公司。主要培养基和。
11、基因是菌株体外生物膜形成的种机制。关键词肺炎克雷伯菌生物膜外排泵温州医科大学硕士学位论文用提高细菌营养物质摄取率。有研究还认为胞外基质之间复杂的吸附和应答作用可以减弱多种药物通过生物膜的渗透性，从而降低生物膜细菌对抗菌药物的暴露率和敏感性，可见生物膜在细菌耐药机制中也发挥重要作用。而目前关于生物膜的研究主要局限在鲍曼不动杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌等，与肺炎克雷伯菌生物膜特性的相关研究资料较少。关于其他菌属的生物膜相关研究报道认为生物膜的形成能力与细菌分离的标本来源有定的相关性，本研究中也发现肺炎克雷伯菌痰液来源的标本形成生物膜的能力远远高于其他标本来源。进步查阅相关临床资料发现我院近的都分离自痰液，同时痰液标本形成生物膜的能力又是最强的，提示我们可能在形成生物膜机制上存在些特殊性，。
12、用接种环在单个菌落表面轻轻接触并向侧面牵拉，如有粘液丝形成且长度大于，判断为阳性。如图所示。图超粘表型试验阳性纤维素生成表型检测将保存的株用接种环三区划线接种至哥伦比亚血平板，次日取单个菌落接种到刚果红平板上，置孵箱中培养，红色菌落代表产纤维素试验阳性，粉色菌落表示不产纤维素，本试验也被称为刚果红试验。如图所示。温州医科大学硕士学位论文图纤维素生成表型试验生物膜形成相关基因的检测细菌基因组的提取试剂盒的准备第次使用前，在试剂瓶中加入溶菌酶，在试剂瓶中加入无水乙醇，在试剂瓶中加入无水乙醇。菌株培养用接种环取环保存菌株，接种到哥伦比亚血琼脂平皿上，培养然后挑取单个菌落至无菌肉汤培养基中，条件下振摇培养至。收集细菌，将上述培养菌液离心，尽可能弃去上清液。向上述沉淀中加入，充分混匀后于下温浴。。
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医学硕士毕业论文---耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌体外生物膜形成特性和相关机制研究