1、死亡信号通路激活从而诱导血管平滑肌细胞凋亡。根据相关的文献资料和本实验室前期的研究工作，我们提出了本实验的工作思路本实验拟采用人源性含全长片段的.，.质粒分别瞬时转染进入血管平滑肌细胞中，再用孵育诱导处理建立泡沫细胞模型后，观察在血管平滑肌细胞内的过表达对细胞内荷脂以及细胞凋亡的影响并探讨其可能机制。如下图万方数据过表达孵育荷脂蓄积万方数据实验材料．细胞株和质粒血管平滑肌细胞购自湘雅中心实验室，由本实验室保存.，.均为本实验室保存。．试剂.主要试剂培养基，美国新生牛血清新西兰产，美国胰蛋白酶，美国磷酸盐缓冲液，中杉金桥北京柱式总抽提试剂盒，生工上海逆转录试剂盒，美国离心柱型质粒小提试剂盒，天根北京蛋白检测试剂盒，碧云天江苏凝胶制备试剂盒，碧云天江苏脂质体，美国，美国，美国细胞裂解液，碧云天江苏，天根北京，美国凯基新型细胞增殖及细。
2、血清的高糖培养基，然后置于，恒温细胞培养箱内进行培养。按照细胞的生长情况约天对其进行次传代，并更换新鲜的细胞培养基。每次实验都选用生长状态良好，处于生长对数期的细胞做实验。.质粒的提取分别取含有.质粒的菌液和含有.质粒的菌液于含有氨苄青霉素的液体培养基中，于恒温摇床震荡过夜。把试剂盒中的吸附柱分别放入到收集管中，再往其加入的平衡液，经离心后倒掉收集管中的废液，再把吸附柱重新放到收集管中，待后续实验用吸取上述菌液于无菌管中，于离心机中常温离心，吸干净上清液体，管中菌体沉淀待用往上述管中加入的溶液，再置于涡旋振荡器上振荡均匀。再加入的溶液，上下翻转次后使管中菌体充分裂解再继续往管中加入的溶液，此时应立即温和地上下翻转次，待溶液混匀管中出现白色絮状沉淀，再将管置于离心机中，常温离心，小心吸取上清至吸附柱中将上述吸附柱置于收集管中，离心。
3、和平滑肌细胞，损伤早期主要是巨噬细胞源性泡沫细胞，中后期病变则以平滑肌源性泡沫细胞为主要病理细胞成分。其典型的病理改变为细胞内胆固醇代谢失衡，胆固醇酯在细胞内大量聚集。胆固醇酯合成多于分解，以脂滴的形式大量地蓄积在细胞中。死亡结构域相关蛋白，是等在年发现的种高度保守核蛋白，可通过信号途径激活氨基末端激酶，通路诱导细胞凋亡。而等研究发现可以降低缺血期间的激活和抑制信号通路，并抑制的活性和磷酸化。还有研究表明在病变过程中过高浓度的肿瘤坏死因子其诱导血管平滑肌细胞的凋亡主要是通过死亡信号通路，它通过激活激酶从而促进细胞凋亡。而在单核细胞转化为巨噬细胞的时候，细胞内的内源性配体表达急增，有人还利用了以及突变和抑制抗抗体等不同手段验证了胆固醇酯诱导单核巨噬细胞凋亡的主要信号通路也是死亡信号通路。而本实验室的前期研究工作发现了当利用氧化型低。
4、毒性检测试剂盒，凯基生物江苏，美国，美国，美国，美国油红染料，美国氨苄青霉素，生工上海万方数据其它试剂均为国产分析纯。.抗体，美国保存。，美国保存。，美国保存。，美国保存。，美国保存。．主要仪器冰箱日本垂直电泳仪上海电泳电源上海电子分析天平美国微量移液器德国生化培养箱医疗器械厂广东仪美国稳压稳流电泳仪六仪器厂北京全自动数码凝胶成像分析系统上海超净工作台安泰空气技术公司苏州倒置荧光光学显微镜日本低温高速离心机德国酶联免疫检测仪美国转膜系统上海脱色摇床恒丰仪器厂江苏全自动化学发光图像分析系统上海万方数据实验方法.质粒的鉴定分别取含有.质粒的菌液于含有氨苄青霉素的液体培养基中，于恒温摇床震荡过夜。取过夜培养的菌液置于.无菌管中，常温快递上海生工生物有限公司进行序列测定。二血管平滑肌细胞培养.平滑肌细胞的培养平滑肌细胞中加入含有的新生牛。
5、分类号密级编号硕士学位论文过表达对诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用研究研究生姓名刘锦红指导教师姓名职称庹勤慧教授学科专业名称药理学研究方向动脉硬化药物蛋白质组学与新药开发年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南华大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名年月日南华大学学位论文版权使用授权书本学位论文是本人在南华大学攻读博硕士学位期间在导师指导下完成的学位论文。本论文的研究成果归南华大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本人同意。
6、的管中，室温下放置使其裂解完全。分别往每个.无酶的管中各加入.氯仿溶液，震荡混匀，室温放置，然后再用离心机进行离心。小心提取上层水相，将其转移到另外个无酶的管中，再根据其体积计算然后加入.倍体积的无水乙醇，混匀。用移液枪将得到的溶液加至柱中，置于室温下，再用离心机进行离心，离心完毕，取出柱，倒掉收集管中的废液。分别把的加入到柱中，放置于室温后，再用离心机进行离心，倒掉收集管中的废液。再重复次。将柱放到收集管后，再用离心机进行离心。往新的无酶的管中放入上述所得柱，往吸附膜的中央部位轻轻滴加，静置于室温下后离心，将得到的溶液进行后续试验。.逆转录合成按照逆转录试剂盒说明书进行相关操作在.的无酶的管中加入如下反应体系万方数据到轻轻混匀，轻微短暂离心后，于仪中孵育。在上述管中加入下列反应体系总体系为。轻轻混匀，短暂离心。仪上逆转录程序为。
7、号调节激酶逆转录聚合酶链式反应聚丙烯酰胺凝胶电泳牛血清白蛋白第五组分蛋白质免疫印迹肿瘤坏死因子氧化型低密度脂蛋白特异性小干扰万方数据过表达对诱导血管平滑肌细胞凋亡的作用研究硕士研究生刘锦红导师庹勤慧教授摘要目的探讨对诱导的血管平滑肌细胞凋亡的影响以及可能的机制。方法体外培养大鼠源性血管平滑肌细胞，然后分别将人源性.，.质粒瞬时转染进入血管平滑肌细胞中，并通过和两种方法检测平滑肌细胞内的表达然后再用孵育小时，建立泡沫细胞模型，油红染色检测细胞内脂滴情况。再分别采用法检测血管平滑肌细胞的细胞活性，流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡情况。检测，的表达情况。为了进步明确通路在诱导的平滑肌细胞凋亡中发挥的作用，我们采用特异性抑制剂对其诱导的平滑肌细胞进行干预。结果转染后细胞经和检测细胞内表达明显增加用孵育后，.组细胞内胆固醇蓄积明显，细胞。
8、后，将溶液和溶液混匀在起，培养箱孵育。在混合溶液孵育的过程中，先把铺好板的孔培养板中的培养基吸干净，再分别用无血清培养基清洗孔中细胞遍，再吸取无血清培养基加入到孔中。后，将含有脂质体和目的质粒的混合液轻轻地逐滴加到孔板中，轻轻摇动培养板使其与培养基混匀。然后将六孔板置于，的细胞培养箱中培养。后，吸掉六孔板中的培养基，再分别往每个孔中加入含有血清的培养基，置于在，的细胞培养箱中培养后，进行后续实验。万方数据三检测血管平滑肌细胞的表达.血管平滑肌细胞总的提取实验分组正常细胞组组，.转染组组，.转染组。瞬时转染后，分别取各个组别生长状态良好，处于生长对数期细胞提取总。按照提取试剂盒说明书进行操作取瞬时转染后的细胞，先用清洗三遍，然后倒掉，残余的用滤纸吸干，按照每培养瓶加入试剂加入液，用移液器轻轻吹打细胞，使其混匀，然后将液体收集至.无。
9、南华大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印缩印或其它手段保留学位论文学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库，并按中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程规定享受相关权益。同意授权中国科学信息技术研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。对于涉密的学位论文，解密后适用该授权。作者签名导师签名年月日年月日万方数据目录缩略词表二中文摘要三英文摘要四正文引言实验材料实验方法实验结果讨论结论五参考文献六综述七发表文章八致谢万方数据缩略词表缩写词英文中文名称动脉粥样硬化血管平滑肌细胞死亡结构域相关蛋白胆固醇环糊精细胞计数试剂盒二甲基亚砜氨基末端激酶凋亡。
10、密度脂蛋白,处理小鼠源性巨噬细胞.，可上调和小凹蛋白的表达，从而促使.细胞凋亡而用特异性小干扰，干扰在.细胞中的表达能降低的表达，则可抑制细胞凋亡。结果表明，对诱导.巨噬细胞凋亡具有介导作用。我们实验万方数据室还发现了在人肝癌细胞中的过表达对过氧化氢诱导的细胞凋亡有加强作用，这作用可能与协同增加活性有关。不仅如此，在人肝癌细胞中的过表达还影响着细胞内胆固醇的蓄积代谢。上述均表明可能在的发生与发展中起着定的作用。血管平滑肌细胞是构成血管壁的重要组成成分，越来越多的动物实验和临床资料表明其凋亡参与了动脉粥样硬化及再狭窄的发生发展，但是在血管平滑肌细胞中的作用机制尚无相关文献报道。等在年就成功的用，胆固醇，环糊精混合物诱导平滑肌细胞形成泡沫细胞，因此我们拟在孵育诱导的血管平滑肌细胞建立肌源性泡沫细胞模型的基础上进行实验研究，猜测可能通。
11、活性下调，凋亡率增加，细胞内，的表达明显增加经处理后，用诱导的.组细胞活性明显增高，同时蛋白的表达水平明显减弱。结论蛋白能够促进孵育诱导的血管平滑肌细胞凋亡，可能与上调表达，表达有关。关键词血管平滑肌细胞细胞凋亡万方数据,,.,,.万方数据.万方数据引言动脉粥样硬化，所引起的心脑血管疾病是目前严重危害人类身体健康的主要疾病之，也是多种心脑血管疾病发生的病理基础，其对心脑血管的损害及伤害可累及到身体的各个器官。经典的脂质学说认为当脂质在泡沫细胞中不断发生沉积，再加上多种炎性细胞的逐步侵润，纤维帽逐渐变薄，使得动脉壁发展到更复杂的纤维斑块，慢慢演变为不稳定的斑块。因为这些斑块富含泡沫细胞，所以易发生破裂。不稳定斑块破裂引发血栓形成，最终导致严重的心脑血管损害,。众所周知，泡沫细胞的形成是进展中最重要的核心环节，而泡沫细胞来源于巨噬细。
12、，倒掉收集管万方数据中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中往上述吸附柱里加入的漂洗液，离心后，倒干净收集管中的废液，再将吸附柱重新放回收集管中再重复步骤次再将吸附柱离心，后打开吸附柱的盖子，于常温下放置后再用于后续实验将上述所得的吸附柱放入灭菌过的管中，再用移液器往其吸附膜中间加入的洗脱缓冲液，先在室温下放置后再离心，将管中所得到的液体分别取用于.琼脂糖凝胶电泳验证，其余样品于保存备用。.脂质体瞬时转染细胞铺板在转染的前天，先把平滑肌细胞消化下来并进行细胞计数，然后按照个孔的细胞密度接种到孔细胞培养板中，待孔中细胞长到融合度的时候再用脂质体分别进行细胞转染。准备溶液先往管中加入无血清培养基，再把的脂质体加入其中，轻微混匀，孵育准备溶液根据脂质体说明书，先往管中加入无血清培养基，再用移液枪吸取的目的质粒滴加进去，轻微混匀。待溶液孵育。
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日本无条件投降日PPT课件（纪念） 编号57