1、均匀浸没细胞，置于冰上，用细胞刮轻柔刮下细胞，转移到去的管中，置于冰上。取氯仿氯仿体积体积加到管中，颠倒混匀，冰置，离心。将上清转移至管中，加等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰置，离心。用负压泵将上清吸净，加入预冷的乙醇用水配制，颠倒混匀，离心。用负压泵吸弃上清，置管于冰上，开盖待其自然干燥。万方数据三峡大学硕士学位论文向管中加入水溶解，于保存。电泳验证取于个管中，吹打混匀，上样至琼脂糖凝胶孔中，电泳，凝胶成像检测的完整性，总按分子量从大到小有三种高丰度的，电泳形成三条明亮的条带，若降解，这三条带会减弱甚至消失，分子量小的条带的亮度会显著增加。

2、复步骤次。将空柱以离心，弃收集管。将柱子放入管中，对着滤膜悬空滴加，静置，室温离心，弃柱子。测定质粒的浓度和纯度在管中，用将纯化后的质粒稀释倍，以等体积的作为阴性对照。打开分光光度仪，预热，清洗皿并用滤纸条擦干，用阴性对照调零，再测定并读取质粒的和值值反映质粒的纯度般值在左右说明纯度较高，值小于说明残留有蛋白质或乙醇，值大于说明残留有。质粒的计算公式浓度。测序及序列比对取纯化的质粒溶于中，封口膜密封，管上做好标记，另外可取含有甘油的菌液备用。测序订单需准确填写载体名称测序引物万方数据三峡大学硕士学位论文插入片段长度双向测序，送往上海生工进行质。

3、液，用轻轻洗涤次，然后每孔中加入。在倒置荧光显微镜下观察细胞内的荧光及定位情况。在细胞内的表达水平用转染试剂将质粒转染至细胞中取对数生长期的和，按照个细胞孔的密度分别接种孔板的个孔进行培养，分成两组。待细胞融合达时，更换新鲜培养基。组取转染试剂加到中纯化过的质粒加到中，轻弹混匀，室温放置，然后将两者混合，轻弹混匀，室温放置，分别取总体积的滴加到对应和的孔中，分散均匀滴加，然后轻轻晃动培养基使其充分混匀。另组不转染，作为阴性对照。置于培养箱中培养。抽提细胞总试剂转染组和未转染组细胞培养，至对数生长期时，弃培养基，用滤纸充分吸尽残留培养液，各孔加入试。

4、疫共沉淀获得的相关功能蛋白第五部分质谱分析的相关功能蛋白讨论小结参考文献综述后记万方数据三峡大学硕士学位论文英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称胎牛血清碱基对极，封口膜密封。将管置于水浴箱中酶切后，加入上样缓冲液，充分混匀，上样至琼脂糖凝胶的个孔中。按照总体积其中上样缓冲液质粒，充分混匀，上样至琼脂糖凝胶的个孔中。取上样至琼脂糖凝胶的个孔中。以恒压电泳，凝胶成像仪成像，观察并记录结果。纯化质粒从取出质粒，加入倍体积的，反复吹打混匀。将上述混合物转移至带有收集管的柱子中，静置，室温离心，弃收集管中液体。加入洗涤液，室温离心，弃收集管中液体。重。

5、加吹打重悬细胞，取至管中，再加入台盼蓝染色液，吹打混匀，取滴加到干净的计数板上，盖上载玻片，迅速在显微镜下计算白色发亮的活细胞数目上下左右大格活细胞总数个。按照个细胞孔的密度取相应体积的细胞悬液分别接种孔板的个孔万方数据三峡大学硕士学位论文进行培养，分成两组。待细胞融合达即处于对数生长期时，更换新鲜培养基。组取转染试剂加到不含血清和抗生素的培养基中纯化后的质粒加到中，室温静置，再将两者混合，室温静置，分别取总体积的滴加到对应和细胞孔中，分散均匀滴加，然后轻轻晃动培养基使其充分混匀。另组除将质粒用空载体替换外，其余处理均同前组。置于培养箱中培养。弃培。

6、测定的浓度和纯度在管中，用水将稀释倍，以等体积的水作为阴性对照。打开分光光度仪，预热，清洗皿并用滤纸条擦干，用阴性对照调零，再测定并读取的和值值反映的纯度般值在左右说明纯度较高，值在左右说明残留有，值在左右说明残留有蛋白质和乙醇。的计算公式浓度。逆转录为逆转录试剂盒根据浓度，定量为，加入相应体积的，取，加补充至总体积，吹打混匀，瞬离。放入仪中取出后置于冰上。将的混合物，混匀后加到中的混合物中，混匀，瞬离。放入仪中然后即得到，取出后置于保存。检测在细胞内表达实验组为转染的细胞，空白对照组为未转染的细胞，内参标准为。的检测引物序列上游引物，下游引物，。

7、测序。测序报告为份彩色图谱和份碱基序列，用软件查看测序图谱，用软件比对碱基序列。细胞培养复苏细胞将细胞从冻存盒中取出，迅速将冻存管的下半部分浸没于水浴箱中，轻轻摆动以加速解冻，当管内仅剩下小块冰时，喷乙醇，在超净台中，将冻存管内的液体全部转移至个盛有的无菌离心管中，以离心，弃上清，加入重悬，转移至细胞培养瓶中，置于培养箱中。传代细胞待细胞汇合度达左右，进行细胞传代，弃培养液，用清洗次，加入消化不同的细胞消化时间不同消化，消化，浸没细胞面，轻轻拍打细胞瓶，肉眼见白色幕状物流动后迅速加终止消化，轻轻吹打细胞至完全吹下，转移至离心管中，离心，弃上清，加入。

8、峡大学硕士学位论文内容摘要目的获得转录因子稳定高表达的细胞株，通过免疫共沉淀和质谱分析技术筛选能与相互作用的蛋白质因子，以阐明在淋巴结中调控外周组织抗原基因表达的分子机制及外周免疫耐受建立维持的机制，为型糖尿病早期干预和治疗提供新策略。方法用转染试剂将质粒和分别转染和细胞株，经小时后，通过荧光显微镜观察在种细胞中的定位。用转染试剂将质粒分别转染和细胞株，同时设置相应未转染的空白对照组，经小时后，通过法和法检测在种细胞中表达水平，通过法检测在种细胞中蛋白表达水平。用转染试剂将质粒转染细胞，经小时后，用的筛选阳性克隆，挑取单个阳性克隆扩大培养，用免疫荧。

9、悬沉淀，按传的比例分装入无菌的细胞瓶内，置于培养箱中，定时在显微镜下观察细胞的生长状态。冻存细胞待细胞汇合度达左右状态良好时进行细胞冻存，在超净台中，弃上清，用清洗细胞次，加入消化后，加入终止消化，轻轻吹打细胞至完全吹下，转移至离心管中，离心，弃上清，加入的细胞冻存液，重悬细胞，转移至无菌冻存管中，在管壁标注冻存日期冻存者和细胞名称，放入冻存盒平衡至室温中，于放置后，从冻存盒取出转移至的盒子中保存，将冻存盒置于室温。在细胞内定位和表达荧光显微镜观察在细胞内定位取和两种细胞，待细胞处于对数生长期。细胞计数用胰酶将细胞消化后转移至离心管中，离心，弃上清。

10、已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据。

11、和检测鉴定稳定表达的细胞株。抽提和正常细胞的核蛋白，用亲和珠子进行，分离，挑选明显富集和对照泳道没有的条带做质谱分析，明确的相关功能蛋白。结果荧光显微镜下可见定位于细胞核。检测转染组的表达水平明显高于未转染组，分别为和，差异具有统计学意义法检测转染组有融合蛋白表达。成功获得稳定高表达的细胞株。经筛选和质谱分析得到些的相关功能蛋白。结论成功获得稳定高表达的细胞株，经筛选和质谱分析获得了些相关的功能蛋白，为阐明调控外周组织抗原表达的分子机制及外周免疫耐受建立维持的机制奠定了重要的实验基础。关键词稳定表达免疫共沉淀质谱分析筛选万方数据三峡大学硕士学位论文。

12、增片段大小的引物序列上游引物，下游引物，扩增片段大小。反应总体系，见表，添加各反应物按照体积从大到小的顺序，聚合酶最后加，吹打混匀，瞬离，放入仪中。表反应体系万方数据分类号密级公开硕士学位论文转录因子相关功能蛋白的筛选学位申请人伍仙凤学科专业免疫学指导教师李书国副教授盛德乔教授二四年五月万方数据，万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体。

参考资料：

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