1、丙酮脱水，包埋，光镜下进步确认已切到梗死灶周皮层后，行超薄切片。醋酸铀构椽酸铅双重染色后日立型透射电镜进行超微结构观察并照相。具体步骤如下制样预固定将约等于的组织块在室温下浸入戊二醛磷酸缓冲液漂洗磷酸缓冲液充分浸洗次，次后固定锇酸缓冲液，室温下漂洗磷酸缓冲液充分浸洗次，分钟次系列脱水丙酮丙酮丙酮丙酮次，次丙酮次，次浸透分别用丙酮与包埋剂按比例及纯包埋剂各浸透包埋用纯包埋剂聚合烘箱，。修块用手工对包埋块进行修整成金字塔状的长方形。万方数据半薄切片定位用超薄切片机切成厚的切片，干燥后经甲苯胺蓝染色，用光学显微镜观察定位。超薄切片用超薄切片机切成厚的切片，载网捞片。染色醋酸。

2、最多，与其行为学症状轻重程度具有致性。在缺血侧视前区大脑皮质，组未见及明显表达组再灌注后，及均有明显表达，达顶峰，有下降趋势，但仍高于假手术组，较前有上升趋势组相应时间点的表达较组少，的表达较组明显增多，从总体呈上升趋势组相应时间点的表达较组少，的表达较组明显增多，从总体呈上升趋势。结论大鼠脑缺血再灌注损伤可使神经细胞内溶酶体激活。在脑缺血再灌注损伤早期，大鼠脑缺血半暗带与的表达可能有相关性。在脑缺血再灌注损伤中，单独通过抑制溶酶体释放的组织蛋白酶能部分阻止半暗带的表达。关键词脑缺血再灌注损伤溶酶体凋亡。万方数据溶液。为检查侧脑室注射部位的准确性，另取批大鼠，同法注入。

3、重。首次评分在分为造模成功，提前死亡生命体征不平稳术中出血过多及断头取脑时发现有蛛网膜下腔出血或脑出血的动物均予以剔除，并随机补充。标本处理取材部位在大鼠模型，对于缺血侧大脑半球距离嗅球尖端处的脑组织，纵向切除距大脑矢状裂中线两侧的脑组织，其余的上脑组织即额顶叶皮质和内侧尾壳核由大脑前动脉和大脑中动脉双重供血，缺血较轻，表现为半暗带的变化下脑组织即尾壳核和下部顶叶皮质，由于仅有大脑中动脉供血，梗死出现早而完万方数据全，可代表缺血中心区。见下图。透射电子显微镜观测步骤观察组大鼠脑缺血半暗带中神经细胞内溶酶体激活及凋亡情况。将已放在戊二醛中固定的标本再以饿酸后固定，上行梯。

4、凋亡。的表达。关键词脑缺血再灌注损伤溶酶体可能有相关性。手术组，较前有上升趋势组相应时间点的表达较组少，的表达较组明显增多，从总体呈上升趋势组相应时间点的表达较组少，的表达较组明显增多，从总体呈上升趋势。结论大鼠脑缺血再灌注损伤可使神经细胞内溶酶体激活。在脑缺血再灌注损伤早期，大鼠脑缺血半暗带与的表达可能有相关性。在脑缺血再灌注损伤中体激活。在脑缺血再灌注损伤早期，大鼠脑缺血半暗带与的表达组明显增多，从总体呈上升趋势。相应时间点的表达较组少，的表达较组明显增多，从总体呈上升趋势组相应时间点的表达较组少，的表达较的表达，假手术组几乎不表达，组表达较少，组表达居中，组表达。

5、术组仅将线栓插入工以约，其余步骤同手术组。术中和手术前后室温控制在，术后大鼠苏醒前均用电灯泡照射大鼠保暖以保持直肠温度。术后大鼠单独置于笼中自由进食水，根据不同的实验目的于响应时间点将造模成功的大鼠进行组织处理。模型纳入标准神经功能缺损评分参照级标准评分法及罗勇神经病学评分改进，待大鼠麻醉清醒后进行首次神经症状评分。分无神经系统功能缺失，活动正常分轻度局灶性神经功能缺失不能完全伸展左侧前爪，右侧征阳性分中度局灶性神经功能缺失提尾悬空时左前肢屈曲内收，爬行时出现向左侧转圈分重度神经功能丧失站立不稳，行走时向偏瘫侧倾倒分不能自发行走，有意识障碍。分数越高，动物行为障碍越严。

6、双氧铀染色，蒸馏水清洗后再用柠檬酸铅染色。观察透射电子显微镜。拍照图像采集系统。蛋白印迹法检测目的蛋白表达组织中总蛋白的提取将取好的大脑皮层组织，每脑组织加裂解液，冰上研磨制备组织匀浆，将组织匀浆液吸出放到离心管中。组织充分裂解裂解后，在下离心取上清液置于新的离心管中，保存在冰箱备用。蛋白定量法测定各样本的蛋白浓度用蛋白测定试剂盒测定蛋白含量，用细胞裂解液将上样蛋白浓度调成致。以各孔所测值为横坐标及相应蛋白浓度为纵坐标绘制标准曲线，根据各待测蛋白管值计算出各管待测样品相应蛋白浓度。测得样品浓度稀释倍数样品终浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳将两块玻板和齿梳洗净后，再用酒精擦拭，。

7、蓝墨水，切开侧脑室检查注射部位，注射准确率为。大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的建立线栓制备选实验用直径为三种尼龙线根据动物体重及颈总动脉管径选取，长，分别在处标记，前端烧成小圆头，在处作好标记，并用多聚赖氨酸浸泡，然后凉干备用。经过处理的栓线对血管损伤小，操作简单，模型稳定性好。手术方法参考方法并加以改进制作可逆性大脑中动脉闭塞，线栓法局灶性脑缺血再灌注模型。将麻醉好的大鼠仰卧位固定于手术台上，剪好根号手术线备用，备皮，碘伏消毒术野皮肤。行颈前正中纵行切口，钝性分离暴露右侧颈总动脉，颈外动脉，颈内动脉仔细剥离迷走神经，避免损伤神经。结扎近心端和根部，以免线栓误入万方数据。

8、移槽的温度不致升高转膜完毕后，轻轻将膜取出做好正反面标记后放入封闭液中封闭。免疫印迹转膜结束后，以洗膜，室温温和摇动封闭将做好标记的膜，浸没于封闭液脱脂奶粉溶液中缓慢摇荡。抗孵育将封闭好的膜洗涤次后，加入塑封袋中，加入抗分别为，抗体兔抗，使膜充分浸没到抗中，室温下在摇床上摇后转入冰箱内过夜。洗膜孵育好后剪开塑料袋，弃去反应液，的洗次次，室温下摇床温和震荡洗涤二抗孵育将膜置于辣根过氧化物酶标记的公司山羊抗兔溶液的小槽内，置于摇床上室温平缓摇动万方数据洗膜取出膜，在中洗次次，室温下摇床温和震荡洗涤。显色将洗涤后的膜放入塑封袋内加入发光液，暗室曝光。柯达洗片机洗光片。结果分。

9、，并且防止阻断颈内动脉后，同侧颈外动脉代偿供血。蛙心夹夹住，并在靠近分叉处置丝线备用。在距分叉部约处剪形切口，左手将及的结扎线轻轻提起，将制备好的线栓自切口处轻轻插入线栓弧线偏向头侧，移去上的蛙心夹，经分叉处缓慢进入，向前推进遇有轻微阻力感时，表明尼龙线头已经进入并且已经阻断血流，回抽少许并注意线栓标记处与分叉处的距离，线拴插入深度约为。此时，固定尼龙线，并计时。手术结束后逐层缝合，尼龙线留于皮外，用记号笔标记，便于拔线时观察。缺血后将线栓退出至标记处，不完全拔出，使线拴头端留在内，防止形成皮下血肿，此时依靠对侧脑血流通过大脑前动脉交通支实现右侧脑组织血流再灌注。假手。

10、排已知分子量的标准物，不用上样的空加入等体积的凝胶上样缓冲液电泳。开始时电压为，待溴酚蓝进入分离胶后，将电压增加到，继续电泳直到溴酚蓝达到分离胶底部，断开电源卸下玻板，在缓和的流水中轻轻撬开，取出凝胶，切去基层胶，在凝胶的角切去小块以便在染色及干胶后仍能认出加样次序。转膜切张滤纸和张膜，其大小与凝胶大小完全吻合将膜在甲醇中浸泡分钟，将膜和滤纸浸入转移缓冲液中，充分平衡展开转移夹，在黑色面依次放上转移海绵垫滤纸张凝胶膜滤纸张转移海绵垫，确保备层精确对齐并不留气泡，整体夹入三明治转移装置夹紧，移入已置有转移缓冲液冰盒的中通电转移，电压，转膜，在时，更换转移槽中的冰盒，使转。

11、析将胶片扫描拍照，用图像分析软件分析蛋白条带，目的蛋白与内参条带光密度的比值作为蛋白质的相对含量。统计学分析运用软件进行统计学处理，观察指标以均数标准差表示，采用单因素方差分析，组间比较采用检验表示差异有统计学意义。万方数据分类号密级编号硕士学位论文与在大鼠脑缺血再灌注损伤中的关系研究生姓名李春花指导教师姓名职称张智博教授学科专业名称神经病学研究方向脑血管病年月万方数据南华大学学位论文原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不。

12、晾干，安装在配胶架上配置先配制的分离胶，迅速将配置好的分离胶小心灌注到两块玻璃板间隙中，为基层胶留出距离玻板顶部约的空间梳齿长加，小心地用双蒸水覆盖，室温垂直放置待分离胶聚合完毕后约，倒掉覆盖层，再用双蒸水反复冲洗凝胶上部数次以除去残留的丙烯酰胺，尽可能用吸水纸吸干凝胶上的液体将配置好的基层胶直接灌注到聚合好的分离胶上层，立即在其中插入块干净的齿梳，不能混入气泡，室温下垂直放置待基层胶聚合后约，小心移去齿梳并用双蒸水冲洗梳孔以洗去加样槽内未凝聚的丙烯酰胺，将玻璃板安装至电泳槽中，加入变性蛋白质电泳缓万方数据冲液，并浸没胶及梳孔，检查是否泄漏，排除气泡按预定次序上样，安。

参考资料：

[1]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号37（第36页，发表于2022-06-25）

[2]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号58（第36页，发表于2022-06-25）

[3]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号42（第36页，发表于2022-06-25）

[4]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号41（第36页，发表于2022-06-25）

[5]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号55（第36页，发表于2022-06-25）

[6]老年人健康管理知识普及演讲PPT 编号31（第36页，发表于2022-06-25）

[7]铁三角团队模式运行培训PP 编号38（第21页，发表于2022-06-25）

[8]铁三角团队模式运行培训PP 编号32（第21页，发表于2022-06-25）

[9]铁三角团队模式运行培训PP 编号34（第21页，发表于2022-06-25）

[10]铁三角团队模式运行培训PP 编号33（第21页，发表于2022-06-25）

[11]铁三角团队模式运行培训PP 编号32（第21页，发表于2022-06-25）

[12]铁三角团队模式运行培训PP 编号32（第21页，发表于2022-06-25）

[13]铁三角团队模式运行培训PP 编号49（第21页，发表于2022-06-25）

[14]铁三角团队模式运行培训PP 编号38（第21页，发表于2022-06-25）

[15]铁三角团队模式运行培训PP 编号61（第21页，发表于2022-06-25）

[16]铁三角团队模式运行培训PP 编号27（第21页，发表于2022-06-25）

[17]微党课拒绝舌尖上的浪费杜绝餐饮浪费《（制止餐饮浪费行为作出重要指示）解读》PPT 编号43（第25页，发表于2022-06-25）

[18]微党课拒绝舌尖上的浪费杜绝餐饮浪费《（制止餐饮浪费行为作出重要指示）解读》PPT 编号35（第25页，发表于2022-06-25）

[19]微党课拒绝舌尖上的浪费杜绝餐饮浪费《（制止餐饮浪费行为作出重要指示）解读》PPT 编号35（第25页，发表于2022-06-25）

[20]微党课拒绝舌尖上的浪费杜绝餐饮浪费《（制止餐饮浪费行为作出重要指示）解读》PPT 编号29（第25页，发表于2022-06-25）