1、褐色的病斑,边缘界限不明显,上面常具球形或不规则的黑色菌核,菌核直径约。分生孢子盘黑褐色,圆形或长形,直径。刚毛聚生在分生孢子盘中央或散生于孢子盘中,刚毛黑褐色,顶端较尖,隔隔,。分生孢子梗圆筒形,偶有隔膜,无色至淡褐色,直分生孢在的缓冲液中溶解,必要时保存在冰箱内。利用空层析柱纯化包含高浓度腐殖质的,程序如下葡萄糖凝胶添加到柱上,粉添加到柱的顶端。柱经过两次连续的添加,每次都跟随次的离心犵。添加到粉的顶端,离心犵然后停留允许渗透到孔中,随后两次连续离心和犵。纯化的洗出液保存在新的无菌管中。犆犘犆犚扩增犆引物第对引物属的专化性引物第对引物种的专化性引物犆反应体。

2、双层普通滤纸过滤,有条件的可以用孔径的滤膜过滤次除菌,或直接置于冰箱中保存备用。犅半选择性培养基培养基和琼脂加在蒸馏水中,灭菌。为了抑制细菌,当培养基在灭菌冷却至左右时加入氯霉素和红霉素各,硫酸新霉素,盐酸环素。马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法。犛犖犜土壤样品的收集如果发现马铃薯块茎表面携带土壤,则用毛刷轻轻刷下粘在块茎表面以及芽眼上的土壤如果携带土壤较少,则用水洗并收集土壤注意收集散落在包装内外的土壤。收集的土壤用塑料袋装好并加贴标识带回实验室检测。实验室检验土壤中病原菌分离收集到的土壤随机取钠消毒,无菌水冲洗次次,置于培养基上,下分离培养,后体视显微镜下观察。出现菌落。

3、到粉的顶端,离心犵然后停留允许渗透到孔中,随后两次连续离心和犵。纯化的洗出液保存在新的无菌管中。犆犘犆犚扩增犆引物第对引物属的专化性引物第对引物种的专化性引物犆反应体系将以下各组分依次加入离心管内混合均匀反应缓冲液,每种氯化镁引物糖凝胶,移液器取扩增产物和上样缓冲液混合,点样到凝胶上的样品孔中,用作为分子量标记,电压下电泳。电泳结束经染色后在凝胶成像系统观察照相并记录。犆结果判断阴性对照无条带产生,阳性对照在产生条带,产物在处有特异性条带,则带有马铃薯炭疽病菌。若在处无特异性条带,则表示未感染马铃薯炭疽病菌。犛犖犜。鉴定特征马铃薯块茎上的特征马铃薯块茎上形成银色。

4、将表面用的次氯酸钠消毒,无菌水冲洗次次,取下小菌核置于培养基上,黑暗中下培养促进产孢。培养物菌丝体的犘犆犚检测见附录。块茎以及土壤中病原菌的巢式犘犆犚检测见附录。鉴定特征马铃薯块茎上的特征马铃薯块茎上形成银色至褐色的病斑,边缘界限不明显,上面常具球形或不规则的黑色菌核,菌核直径约。分生孢子盘黑褐色,圆形或长形,直径。刚毛聚生在分生孢子盘中央或散生于孢子盘中,刚毛黑褐色,顶端较尖,隔隔,。分生孢子梗圆筒形,偶有隔膜,无色至淡褐色,直分生孢子圆柱形,下尖上圆,单胞,无色,直,有时稍弯,养基灭菌冷却至左右时加入。土壤浸出液的制作方法田园土加蒸馏水,充分搅拌后静置,上清液用。

5、体经检测,在处有特异性条带,阴性对照无条带产生,阳性对照亦产生条带的,可判定该病菌为马铃薯炭疽病菌。块茎土壤中病原菌经巢式检测后,在处有特异性条带,阴性对照无条带产生,阳性对照亦产生条带的,可判定该病菌为马铃薯炭疽病菌。标本和样品保存分离并鉴定为马铃薯炭疽病菌的菌株要转移到斜面上,连同被马铃薯炭疽病菌侵染的块茎及土壤样品于冰箱中保存至少个月,以备复检谈判和仲裁,保存期满后进行灭活处理。马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法。犛犖犜土壤样品的收集如果发现马铃薯块茎表面携带土壤,则用毛刷轻轻刷下粘在块茎表面以及芽眼上的土壤如果携带端。柱经过两次连续的添加,每次都跟随次的离心犵。添加。

6、将以下各组分依圆柱形,下尖上圆,单胞,无色,直,有时稍弯,。培养特征马铃薯炭疽病菌在培养基上,菌落平展,白色,背面深褐色。菌落中常密布黑色的小菌核,菌核犛犖犜球形,直径,菌核呈同心环状排列,菌核上产生分生孢子盘,分生孢子盘上产生大量的分生孢子和刚毛。刚毛变化很大,长,具分隔,顶部很尖。分生孢子自由生长或呈木栅栏状,分生孢子半透明,圆柱形或端变细的棍棒形含个个油球。常见附着孢,长棍棒状,有时形状不规则,边缘锯齿状,中度褐色有时会形成复杂的结构。犘犆犚检测马铃薯炭疽病菌经菌丝体的检测,应在处有特异性条带见附录经块茎和土壤中病原菌巢式检测,在处有特异性条带见附录。结果判定。

7、,将菌落的边缘或分生孢子转移到上继续纯化培养,产孢后进行形态鉴定或利用菌丝体直接进行检测见附录。块茎表面菌核的分离对表面发现黑色小菌核的块茎,将表面用的次氯酸钠消毒,无菌水冲洗次次,取下小菌核置于培养基上,黑暗中下培养促进产孢。培养物菌丝体的犘犆犚检测见附录。块茎以及土壤中病原菌的巢式犘犆犚检测见附录。犃寄主马铃薯炭疽病菌的寄主较广,目前已有报道的涉及个科的种,主要有马铃薯西红柿洋葱草莓红辣椒南瓜茄子冬樱桃胡椒甘蓝水芹莴苣菊花白芥菜灯笼果珊瑚豆曼陀罗等。犛犖犜附录犅规范性附录培养基配方犅基础培养基犅犘犇犃培养基或选用市售犘马铃薯炭疽病菌检疫鉴定方法.为模板加灭菌水至。

8、缓冲液混合,点样到凝胶上的样品孔中,用作为分子量标记,电压下电泳。电泳结束经染色后在凝胶成像系统观察照相并记录。犆结果判断巢式后,阴性对照扩增条带产生,而阳性对照能得到的条带,若产物在处有特异性条带,表明带有马铃薯炭疽病菌,否则表明无马铃薯炭疽病菌。犆块茎和土壤中病原菌巢式犘犆犚检测犆试剂块茎和土壤中土壤较少,则用水洗并收集土壤注意收集散落在包装内外的土壤。收集的土壤用塑料袋装好并加贴标识带回实验室检测。实验室检验土壤中病原菌分离收集到的土壤随机取置于灭菌水中充分振荡,微量移液器取后玻棒均匀涂布在半选择性培养基或选择性培养基上见附录,培养后在体视显微镜下观察。发现菌。

9、体积。置于仪中,进行反应。第对引物扩增变性,然后在变性退火延长条件下循环次,最后延伸。取第轮反应产物,用作第对引物反应的模板,进行第轮反应,反应参数为变性,然后在变性退火延伸条件下循环重复次,最后延伸。犆对照阳性对照以马铃薯炭疽病菌菌株的基因组代替待鉴定菌株的基因组,其他条件相同。阴性对照为代替鉴定病原菌的基因组,其他条件相同。犛犖犜犆产物分析制备琼脂糖凝胶,移液器取扩增产物和上样缓冲液混合,点样到凝胶上的样品孔中,用作为分子量标记,电压下电泳。电泳结束经染色后在凝胶成菌在马铃薯块茎上引起特征,并经培养鉴定符合的培养特征,可以判定为马铃薯炭疽病菌。利用培养所获得的菌。

10、透射仪低温冰箱凝胶成像系统研磨珠均质器空层析柱天平感量。注也可使用市售提取试剂盒。犆犘犆犚扩增犆马铃薯炭疽病菌专化引物犆犘犆犚反应将以下各组分依次加入离心管内混合均匀犛犖犜反应缓冲液,每种氯化镁引物未稀释的为模板加灭菌水至终体积。总体积为或参照反应试剂盒提供的条件。置于仪中,进行反应。反应条件为变性,然后在变性退火延伸条件下循反应。反应条件为变性,然后在变性退火延伸条件下循环重复次,最后延伸。犆对照阳性对照以马铃薯炭疽病菌菌株的基因组代替待鉴定菌株的基因组,其他条件相同。阴性对照为代替鉴定病原菌的基因组,其他条件相同。犆产物分析制备琼脂糖凝胶,移液器取扩增产物和上。

11、后,将菌落的边缘或产生的分生孢子转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基见附录上继续培养,产孢后进行形态鉴定。块茎上病菌分离将现场抽取的马铃薯块茎样品混匀,从中随机抽取个块茎进行检验。逐个检查块茎表面是否有典型的病斑或带有黑色的小菌核,按及进行分离鉴定。块茎表面病斑的分离将表面产生典型病斑以及有怀疑症状的块茎,在流水下冲洗去除表面的杂物后,切下病健交界处的小块组织厚,直径,表面用的次氯圆柱形,下尖上圆,单胞,无色,直,有时稍弯,。培养特征马铃薯炭疽病菌在培养基上,菌落平展,白色,背面深褐色。菌落中常密布黑色的小菌核,菌核犛犖犜球形,直径,菌核呈同心环状排列,菌核上产生分生孢子盘。

12、应缓冲液,吐温。犆块茎犇犖犃的提取挑选带有明显马铃薯炭疽病菌症状的马铃薯块茎,灭菌水洗去掉多余的杂质,从块茎的匍匐茎端至端部切片,厚,切片通过滚压机收集汁液于的包含抗氧化剂的管中,滚压机用的氢氧化钠和乙醇清洗,然后灭菌水清洗,以避免混合污染。提取液在冷藏。的汁液转移至的螺帽管中。研磨珠均质器内搅匀。然后将样品离心犵,上清液采用等体积的氯甲烷抽提,再离心犵。上清液采用的乙酸钠和等体积的异丙醇在室温下沉淀,离心犵,沉淀用的乙醇清洗后,的缓冲液中溶解,必要时保存在冰箱内。利用空层析柱纯化包含高浓度腐殖质的,程序如离心机水浴培养箱制冰机旋涡振荡器电泳仪恒温水浴锅紫外反射。

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