1、溶液逐级脱水甲苯乙醇纯乙醇乙醇乙醇乙醇乙醇乙醇除去甲苯组织复水各级蒸馏水洗苏木素染色盐酸乙醇分色数秒自来水洗约使细胞核变蓝乙醇乙醇乙目前尚未发现其他中间寄主马尔太虫地理分布范围较广如克罗地亚法国希腊意大利摩洛哥葡萄牙及西班牙马尔太虫主要感染欧洲牡蛎中国鹑螺安加西牡蛎贝壳属牡蛎贻贝属的紫贻贝及地中海贻贝等水生软体动物早期折光马尔太虫感染出现在宿主唇的触须和胃的部位孢子在消化腺的管道内形成繁殖体释放在消化道的体腔内随粪便排到外界环境中后。
2、用原位杂交过程中不加入探针非感染的寄主分别进行原位杂交结果判定阳性对照组织切片在显微镜下观察有紫黑色的杂交信号阴性对照无紫黑色的杂交信号在阳性对照阴性对照成立的条件下检测样品通过探针杂交染色后有紫黑色信号的切片被认为阳性结果在马尔太虫分布的地理范围内易感种的原位杂交阳性结果则认为该机体感染了马尔太虫其他非易感种或在马尔太虫疫病区之外若检测结果阳性且组织学或涂片法检测也为阳性结果可确诊为感染马尔太虫原位杂交法样品的采集活牡蛎或开口牡蛎。
3、贝不会因为外界条件的改变而影响其感染该病的经济和生态学影响严重年年马尔太虫病在法国造成了严重的经济损失估计损失亿欧元控制措施马尔太虫病现在还没蛎个体制片前载玻片的准备与涂片法相同制片方法取粟米大小病灶消化腺上皮腮触须粪便置于载玻片中央加入的盐水取另载玻片覆盖压紧用力大小依组织微粒受压后向周展平的难易而定快速平行移动拉开使组织微粒充分展开形成层薄膜后不能让其干掉迅速投入乙醇中固定取出后快速进行苏木精伊红染色染色染色甲苯脱蜡按下列浓度的。
4、类马尔太虫检疫技术规范范围本标准规定了折光马尔太虫的检疫技术规范本标准适用于折光马尔太虫的分离和鉴定也酵母硫酸葡聚糖浸泡切片用原位杂交塑料片覆盖水浴箱密封盒中变性变性完毕将切片放在冰块上迅速降温然后将切片移入湿盒内杂交过夜杂交后漂洗将杂交玻片从湿盒或杂交仪中取出室温下用洗脱次每次洗次显色将切片置于中漂洗用俾斯麦棕复染染色后再用漂洗最后切片用水溶性的封固剂封片保存设立对照阳性对照用感染马尔太虫的寄主进行原位杂交阴性对照设立两个阴性对照。
5、太虫的寄主现在还不清楚传播途径马尔太虫是水平传播的但也有垂直传播途径如在牡蛎中疾病常发生在幼体的胃触须甚至鳃的上皮认为它的原始感染是通过摄食引起的此外马尔太虫可能通过中间寄主传播给贻贝属但目前尚未有试验证实环境因素如温度盐度季节等对马尔太虫病的感染有影响通常认为是该病感染的临界温度其感染率在河口地区明显高于河流上游感染率高达是牡蛎的致死性因子死亡通常出现在夏季和秋季并且伴随着马尔太虫孢子体的形成类似的发病高峰常出现在水温高的时期而贻。
6、期感染通常出现在宿主的消化道消化腺生殖腺感染时宿主除表现消瘦外没有其他明显的外部症状表现严重感染时会导致宿主死亡当严重感染时其组织切片可见柱状的消化腺上皮明显萎缩呈立方形或鳞片状并不同程度的向体腔扩张寄主因素欧洲牡蛎贝壳属牡蛎中国鹑螺安加西牡蛎和贻贝属的紫贻贝及地中海贻贝是折光马尔太虫的主要易感寄主在牡蛎野生群体中龄以上的软体动物是易感寄主马尔太虫感染是牡蛎的致死性寄生虫病感染病早期感染出现在唇的触须和胃的部位后期感染孢子在消化腺的。
7、地高辛标记探针的制备首先用方法扩增马尔太虫基因在反应体系中加入缓冲液聚合酶引物各马尔太虫基因组补充水至若检测人员使用的是合格供应商提供的试剂请按照试剂盒说明书操作反应程序为预热变性退火延伸共个循环最后延伸用产物纯化试剂盒对产物进行纯化再利用地高辛标记试剂盒进行标记得到地高辛标记的探针消化腺上皮腮触须等置于冰箱中备用的提取样品的提取可采用动物组织基因组通用试剂盒按说明书提取也可采用常规抽提法见附录反应体系在反应体系中加入缓冲液聚合酶引。
8、液或粪便前沿方向接触粘液或粪便使其沿推片散开推片与载玻片保持夹角平稳地向前推动粘液或粪便即在载玻片上形成薄层膜滴加姬姆萨染液滴滴固定然后按的比例加缓冲液的磷酸盐缓冲液用洗耳球吹匀染色流水冲洗晾干待检镜检把制好的涂片置于显微镜上观察结果判定呈阳性结果的细胞通常大小在细胞质染色嗜碱性细胞核染色嗜曙红细胞性在细胞中出现许多折光的着色颗粒和白色的光环并且个细胞内有多个马尔太虫细胞马尔太虫疫区内的易感种的检测结果阳性通常被认为该机体感染了马尔。
9、物各模板补充水至若检测人员使用的是合格供应商提供的试剂盒请按照试剂盒说明书操作扩增程序反应程序为预变性变性退火延伸共个循环最后延伸琼脂糖电泳用电泳缓冲液见附录制备的琼脂糖凝胶平板将平板放入水平电泳槽使电泳缓冲液刚好淹没胶面向扩增产物中加入体积的电泳上样缓冲液贝类马尔太虫检疫规范.道的体腔内随粪便排到外界环境中死亡常出现在开始感染的第年因此感染可能会持续年以上或者终身贻贝经常受到马尔太虫的感染但是马尔太虫是否形成孢子体及贻贝是否成为马。
10、切片法予以确诊涂片法样品的采集取开口的或刚死的牡蛎个体制片前载玻片的准备新载玻片常带有游离碱质应用浓度为的盐酸浸泡再用清水彻底冲洗干燥后备用旧载玻片要在含洗涤剂的清水中煮沸再用清水反复冲洗最后用乙醇浸泡干燥备用使用载玻片时不要用手触及玻片表面聚合酶及缓冲液核酸染料或者新型替代染料如俾斯麦棕染液电泳缓冲液见附录引物固定液见附录缓冲液见附录溶液见附录保持玻片清洁干燥中性无油腻制片方法取滴消化腺粘液或粪便置载玻片的端以边缘平滑的推片端从粘。
11、太虫非易感种或马尔太虫疫病区外阳性结果通常要进步证实才能下定论压片法样品的采集鲜活牡书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准贝类马尔太虫检疫技术规范发布实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布书书书前言本标准按照给出的规则起草本标准非等效采用了国际动物卫生组织水生动物疾病诊断手册版中等有关章节本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位中华人民共和国山东出入境检验检疫局中华人民共和国厦门出入境检验检疫局中国检验。
12、道内形成繁殖体释放在消化要在亲牡蛎中取份卵巢液样品对野生混养的蛎群至少两年内每年次采集个个体尽可能优先采取幼龄期老龄及和或雌性卵巢液监测保持期采样的要求经实验室检测年无马尔太虫可疑临床症状后每年还应连续抽检两次每次采集的样品可减少到个并尽可能包括怀卵牡蛎个体但在检疫中发现有濒死的个体时应采取进步的实验室检测马尔太虫病的检测方法以牡蛎为例其他贝类参照此法总则诊断临床感染该病的贝类的理想方法是或法直接检测感染组织然后用压片法涂片法或组织。
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SNT 2713-2010 贝类马尔太虫检疫规范
