1、制备超薄切片。醋酸双氧铀和醋酸铅双重染色，透射电镜观察。免疫组化法二步法检测和的表达实验步骤石蜡标本常规脱蜡至水次脱水，用二甲苯将石蜡切片泡染，需要，二次脱水，无水酒精，需要，三次脱水，各浓度酒精各。液冲洗，抗原煮沸，进行热修复，自然冷却，再次冲洗。用高温消毒的吸水纸吸取石蜡切片上组织旁残留液体，放入湿盒中，添加避光孵育，消除内源性过氧化物酶的活性。万方数据三峡大学硕士学位论文液冲洗，同上吸取石蜡切片上组织旁残留液体，放入湿盒中，添加稀释的抗工作液室温孵育分钟。液冲洗，同上吸取石蜡切片上组织旁残留液体，放入湿盒中，添加标记聚合物于组织上室温孵育分钟。液冲洗，同上吸取石蜡切片上组织旁残留液体，放入湿盒中，滴加显色剂，室温下孵育，光镜下观察显色的效果，成功后终止显色。苏木精复染。各浓度酒精。

2、下见大鼠肝细胞内弥漫大量的脂肪空泡大于作为非酒精性脂肪性肝病成模标准。两者均存在为型糖尿病合并酒精性脂肪性肝病成模标准。未成模者从实验中删除。万方数据三峡大学硕士学位论文标本采集血液标本每周测量大鼠体重及反应情况，各组大鼠成模后，检测，禁食小时，称重，麻醉予水合氯醛，腹腔注射，麻醉成功后，打开腹腔，腹腔主动脉取血，以离心分离血清，部分检测空腹血糖另外冻存于超低温冰箱待测。肝脏组织标本大鼠取血后，迅速留取肝脏，冰盐水冲洗，滤纸吸干水分后称量肝湿重，取部分肝脏组织装于标本夹中浸泡于中性甲醛以固定，待后期光镜观察及免疫组化检测部分浸泡于戊二醛中固定以便后期电镜观察，剩余部分迅速装入无酶冻存管中，标号存放于冰箱，用于实时定量聚合酶链反应，检测和和蛋白印迹法，检测。观察内容及指标检测观察模型动物。

3、贴附后，置于恒温箱中干燥。切片常规二甲苯Ⅰ二甲苯Ⅱ酒精Ⅰ酒精Ⅱ脱蜡次，各分钟，然后水洗。苏木素染液，水洗。伊红染液，水洗。按，无水乙醇的顺序进行脱水。按二甲苯，的顺序进行透明。中性树胶封片，光镜下观察。评估脂肪变性程度。标准分为轻中重三型。轻度光镜下每单位面积见的肝细胞脂肪变。中度光镜下每单位面积见以上的肝细胞发生脂肪变。重度光镜视野中几乎所有肝细胞均发生脂肪变。大鼠肝脏组织电镜形态观察取材迅速取肝脏标本后切成大小，戊二醛固定小时。液浸洗。锇酸固定小时。液再次浸洗。，依次放入乙醇乙醇醋酸铀饱和液中，接着室温下，依次放入各级乙醇中，各分钟。，先后用环氧树脂包埋剂和丙酮浸透小时后包埋。温箱聚合小时后温箱聚合小时。玻璃制刀机制刀，制备半薄切片。碱性复红，次甲基蓝染色各秒后，冲洗。显微镜下定位。

4、在组组中呈低表达，在组及组中呈高表达，且组表达阳性程度与组比较有明显差异。在组中呈低表达，在模型组中呈高表达，且表达阳性程度以组组组依次升高，各组之间比较有明显差异。肝脏脂肪变性程度与的相关性通过相关性分析，肝脏脂肪变性程度与表达存在相关性。相关因子与的相关性通过相关性分析，与表达存在负相关性，及胰岛素抵抗指数表达存在正相关性。结论成功建立了型糖尿病非酒精性脂肪性肝病型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病模型。万方数据三峡大学硕士学位论文在型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的发生及发展过程中，血清的水平可以反映其进展。蛋白参与了型糖尿病的非酒精性脂肪性肝病发生发展过程。通过干预蛋白表达，可能延缓病变进展。关键词型糖尿病非酒精性脂肪性肝病解偶联蛋白炎症胰岛素抵抗万方数据三峡大学硕士学位论文，活检光镜。

5、心除去封板膜，用高温消毒的吸水纸吸干样本表面残留的水分，注入洗涤液，稍微搅拌后弃去，重复以上过程次即可。加酶样本孔加入酶剂。温育密封后置入样本培育箱中保存。洗涤与前过程相同。染色显色剂依次注入样本孔及空白对扎孔中，搅拌均匀，务必避光，整个过程约用分钟。终止终止液注入即停止实验。测定空白孔调零，依次测量各孔在波长下的值。绘制标准曲线，测算样品浓度。检测血清基本原理及检测程序同前。大鼠肝脏组织染色形态观察标本固定剖腹取出肝脏后，放入中性甲醛固定小时。脱水室温下，按无水乙醇的顺序梯度脱水，每浓度中停留。透明二甲苯浸透。浸蜡包埋石蜡中浸蜡次，每次小时，用包埋模具盒将组织铸成蜡块。切片蜡块装切片机上，调节切片厚度，均匀用力，切出连续成带，将万方数据三峡大学硕士学位论文切片水中展片，然后用玻片贴片。

6、逐级脱水，每级脱水约，切片置于二甲苯，封片，光镜下观察。结果判断通过美国公司生产的图像分析软件，测算平均积分光密度，。实验结果判定蛋白表达特异性分布于胞浆内，阳性反应为细胞胞浆呈黄褐色，背景胞核均无黄褐色。每组免疫组化均设不加抗体的阴性对照，结果为阴性。检测和的表达试剂法提取肝脏组织总称取肝脏组织并加入液，在研钵内将组织研碎，并与液充分混匀，冰上低温操作，避免降解。将其完全转移入处理过的管中，在常温下静置离心。取上清，加入的氯仿，氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管秒，使其充分混匀，室温静置分钟。后离心分钟。将上清转移至新的水处理过离心管，加入和提取的上清相同体积的异丙醇，常温静置后离心。小心倒掉上清，留取沉淀。加现配的的乙醇预冷振荡洗涤沉淀次，后离心分钟。弃上清，沥干管中液体，加入无。

7、况及造模评估每天观察大鼠进食及饮水量排泄的尿量毛色活动状况，每周称量大鼠的体重，实验结束计算每组大鼠成模率。生化指标检测测定采用葡萄糖氧化酶法测定。肝指数测定肝指数肝重体重。测定采用双抗体放射免疫分析法测定。胰岛素敏感指数。胰岛素抵抗指数。采用全自动生化分析仪检测。检测血清基本原理采用双抗体夹心法测定实验大鼠水平。用纯化的试剂填充特制的微孔板，固定制成样本固相，在样本中继续加入，制成后平稳摇匀，然后再与抗体混合，这就组成了抗体抗原抗体三体复合物，最后用辣根过氧化物酶，做好标记，已备观察，在恒温摄氏度的温箱中保存小时，这样可使标记物完全均匀，小时后拿出后水洗，洗净后，用甲基联苯胺做底物染色。般开始是蓝色，小时后变为黄色，再长时间都不会再改变。显色好坏主要决定于的浓度高低，般两者呈正相关。。

8、肪性肝病发生的主要原因，解偶联蛋白，是线粒体内膜上调节质子转运的阴离子载体蛋白，与胰岛素抵抗氧化应激能量稳态及糖脂代谢等密切相关。本实验通过构建型糖尿病非酒精性脂肪性肝病及型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病的大鼠疾病模型，研究多种炎性因子及解偶联蛋白，在上述疾病模型中表达的变化，探讨在并发的发生中的作用，为进步研究型糖尿病并发非酒精性脂肪性肝病的发病机制，临床治疗肥胖糖尿病脂肪肝寻求新靶点。方法建立动物模型只雄性健康大鼠随机分为对照组组型糖尿病组组非酒精性脂肪肝病组组型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组组。型糖尿病组予高脂饮食喂养，非酒精性脂肪肝病组与型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组予改良高脂饮食喂养，周后型糖尿病组与型糖尿病合并非酒精性脂肪肝病组腹腔注射链脲佐菌素对照组与非酒精性脂肪肝组腹腔注射。

9、酶标仪测的光密度值万方数据三峡大学硕士学位论文，值，而后根据标准曲线图计算浓度。检测程序稀释般采用较为简单的孔稀释法，在酶板上放置标准大小的孔，以相邻的两个孔做为个单位，分为孔为单位，孔为单位，孔为单位，孔为单位，孔为单位，试验按从小到大的简单顺序依次进行，具体实施方法为，在单位中分别加标准品和稀释液，简单等待完全溶解然后单位各取第次单液，稀释液植入到单位同样的操作方法依次类推，直到单位就可完成此稀释过程。原则为各孔加样，加稀释液浓度分别为，。加样设定空白对照孔，此孔不添加任何实验试剂，设定样品孔，此孔按上述步骤依次加入稀释液，再加入样品，然后固定于酶标板底部。保存用封板膜封闭各个孔，务必避免空气的进入，密封后置入样本培育箱中保存。备洗涤液般使用蒸馏水约即可，不必需要特殊的洗涤液。洗涤。

10、法律后果由本人承担。学位论文作者签名日期三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的切法津和经济后果。学位论文作者签名日期万方数据三峡大学硕士学位论文内容摘要目的近年，型糖尿病，非酒精性脂肪性肝病，发病率逐年增高，而型糖尿病患者中非酒精性脂肪性肝病的发病率达到以上，肥胖胰岛素抵抗，糖脂代谢紊乱是型糖尿病合并非酒精性。

11、量生理盐水。监测大鼠体重，实验结束时，测定空腹血糖随机血糖，肝脏取材，称量肝脏的湿重，计算肝指数胰岛素敏感指数胰岛素抵抗指数，行光镜电镜观察肝脏病理组织学改变。确定各组是否造模成功。全自动生化分析仪检测丙氨酸氨基转移酶，门冬氨酸氨基转移酶，高敏反应蛋白，甘油三酯，以及总胆固醇，。双抗体放射免疫分析法测定血清空腹胰岛素，。酶联免疫吸附法，测定血清脂联素，游离脂肪酸，水平的变化。应用免疫组化检测肝脏组织中和蛋白表达，实时定量聚合酶链反应，检测和的表达，免疫印迹法，法检测肝脏组织中和蛋白表达。万方数据三峡大学硕士学位论文结果生长情况各组大鼠的体重均呈现增长趋势。模型组与组对比体重增长明显，周与周时有明显差异。组与组间无明显差异，组组与组周时无差异，周时有明显差异。大鼠的肝脏形态学变化组组大鼠。

12、水，震荡摇匀，直至沉淀溶解，保存于冰箱中备用。用微量核酸蛋白检测仪检测浓度，检测分别在和处的值，的数值在之间，是实验所要求的理想纯度，否侧考虑蛋白质被污染或者存在的降解，需重新提取。浓度计算值，正常值为，用无核糖核酸酶的去离子水稀释至浓度为。逆转录合成万方数据分类号密级硕士学位论文在型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝病中的表达和意义学位申请人吴琼学科专业免疫学指导教师邹秀兰教授二四年五月万方数据万方数据三峡大学硕士学位论文三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明。

参考资料：

[1]《弘扬传承伟大抗疫精神争做新时代好党员》党课PPT讲稿 编号18060（第20页，发表于2022-06-24）

[2]《弘扬传承伟大抗疫精神争做新时代好党员》党课PPT讲稿 编号18060（第20页，发表于2022-06-24）

[3]《弘扬传承伟大抗疫精神争做新时代好党员》党课PPT讲稿 编号18060（第20页，发表于2022-06-24）

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[5]《利用有效时间提高复习效率》主题班会PPT讲稿 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

[6]《利用有效时间提高复习效率》主题班会PPT讲稿 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

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[10]《利用有效时间提高复习效率》主题班会PPT讲稿 编号18060（第22页，发表于2022-06-24）

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[15]《深入学习解读党的十九届六中全会精神》党课PPT 编号18060（第32页，发表于2022-06-24）

[16]《深入学习解读党的十九届六中全会精神》党课PPT讲稿 编号18060（第32页，发表于2022-06-24）

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